2014年2月，重庆某养殖场1 000羽肉鹅发生了疑似巴氏杆菌感染的急性传染病，根据其形态特征、培养特性、生化鉴定、16S rDNA基因序列分析和小白鼠攻毒试验等进行鉴定，确定是巴氏杆菌引起的急性传染病。根据药敏试验结果进行有效的治疗，病情已得到控制。
1材料与方法
1．1 材料
1．1．1病料：重庆某养殖场送的发病鹅5羽。
1．1．2试剂与仪器：PCR仪(Eppendorf，德国)，电泳仪、凝胶成像仪(Biorad，意大利)；DNA片断回收试剂盒购自TaKaRa公司(大连)；Taq酶、Buffer、 DNA聚合酶、2000 DNA marker、琼脂糖、dNTPs 均购自上海生工生物工程有限公司；营养琼脂、麦康凯培养基、微量生化发酵管、药敏片均购自杭州微生物试剂有限公司。
1．1．3 16S rDNA通用引物：上游引物P1：5 LAGA GTTTGA TCC TGG CTC AG一3’；下游引物 P2：5’一AC GGC TAC CTT GTT ACG ACT-3’。
1．2 方法
1．2．I 流行病学调查：通过询问了解鹅场发病情况，包括鹅群来源、饲养管理及免疫情况、发病主要症状、病死率及用药等。
1．2．2 病理剖检：按常规方法对送检病死肉鹅进行剖检，观察主要脏器的病理变化，并无菌采取病料进行细菌分离鉴定。
1．2．3细菌分离：无菌采取心脏、肝、脾等病变组织接种于兔鲜血平板，37℃培养24 h，挑菌，革兰氏染色、镜检，通过平板划线法进行细菌分离纯化。
1．2．4生化试验：根据微量生化发酵管说明书，取纯化菌株纯培养物分别接种葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、山梨醇、卫矛醇、肌醇、鼠李糖、甘露醇、尿素酶、VP、MR、硫化氢、触酶和氧化酶等生化试管。
1．2．5 16S rDNA基因序列分析：将分离菌采用煮沸裂解法制备细菌基因组DNA模版，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性7 min，94℃变性 60 S，55℃退火60 S，72℃延伸90 S，循环次数30 个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。反应结束后取10 gL PCR产物，用1．2％琼脂糖凝胶电泳观察。PCR产物的回收纯化，送上海生物工程有限公司进行DNA序列的测定。将所测得的序列与 Genbank中的16S rDNA序列进行分析比较。
1．2．6 毒力试验：用分离纯化的细菌培养物注射小白鼠，48 h内观察小白鼠的情况。
1．2．7 药敏试验：将分离的细菌均匀涂布于含兔血琼脂平板表面，将各种抗生素纸片均匀贴在平板表面，每个平板6张，37℃培养24 h，测抑菌圈的直径大小。
2 结果
2．1 流行病学调查与剖检病变
发病鹅群为养殖户的肉鹅，发病前1个星期温度变化大，第4 d开始出现死亡病例，饲养员当时没引起注意，到了第7 d后，平均每天约有10羽鹅发病死亡，曾使用庆大霉素、卡那霉素等药物治疗效果均不明显。发病鹅个别出现厌动、食欲下降、流涎、鼻腔有黏性分泌物，拉绿色或白色稀粪，其他症状不明显。剖检可见肺脏瘀血、出血，气管环状充血；心包大量黄色渗出液或胶冻样渗出物，心肌与心冠脂肪大量点状出血；肝脏质脆，表面有白色或淡黄色针尖大小坏死点；十二指肠充血、出血，肠壁变薄。
2．2 实验室诊断
对采集的病鹅的心脏、肝、脾等病变组织进行病原分离，结果分离到1株革兰氏阴性小杆菌，该菌在麦康凯琼脂平板上不能生长，可在营养琼脂平板上生长，在兔血平板37℃培养24 h可见中等大小的淡灰白色、湿润、露珠样菌落，无溶血性，革兰氏染色、镜检可见两端钝圆的杆菌。
2．3 生化试验结果
显示葡萄糖、蔗糖、果糖、触酶试验和氧化酶试验阳性，而麦芽糖、乳糖、山梨醇、卫矛醇、肌醇、鼠李糖、甘露醇、尿素酶、VP、MR反应阴性，产生硫化氢。与多杀性巴氏杆菌生理生化特征相符合。结果见表1。
2．4 16S rDNA基因序列分析
以P1和P2为引物，将分离菌采用煮沸裂解法制备细菌基因组DNA模版，优化缓冲体系和镁离子浓度，可以扩增出约1 500 bp的特异条带。从琼脂糖凝胶上切割特异性条带，试剂盒回收纯化PCR产物，送上海生物工程有限公司进行DNA序列的测定。将所测得的序列与Genbank中的16S rDNA 序列进行相似性分析比较，与多杀性巴氏杆菌(菌株的登录号为：CP003022)的16S DNA序列的同源性达到了99％。综合生理生化鉴定和16S rDNA 测序的结果，可以认为该菌为多杀性巴氏杆菌。
2．5 毒力实验
用分离纯化的细菌培养物浓度2．5×108 CFU／g，注射小白鼠，8 h内10只小白鼠全部死亡。
2．6 药物敏感性试验结果
对分离得到的多杀性巴氏杆菌进行药敏试验，结果表明该菌对头孢曲松钠、头孢氨噻肟高度敏感；对诺氟沙星、利福平、先锋必素、新霉素、磺胺异恶唑和先锋霉素V低度敏感；而对美满霉素、氟苯尼考、淋必治、强力霉素、痢特灵、阿莫西林、奥复星、复方新诺明、洁霉素和万古霉素不敏感。结果参照表2。
3讨论与结论
近年来，禽霍乱的发生有上升的趋势，加之该病病程短促，发病率和死亡率都较高，给养禽业造成巨大的经济损失。应加强对该病的免疫预防，避免该病的发生和流行，以保护和促进养禽业的健康发展。对发病的鹅场采用头孢曲松钠和头孢氨噻肟药物治疗，同时采用巴氏杆菌自家苗，使疫情得到了有效的控制。本研究从发病鹅肝脏、心脏、脾脏中分离并纯化的细菌，经形态特征、培养特性、生化鉴定及PCR 鉴定结果，确定从发病鹅中分离的细菌为多杀性巴氏杆菌。根据药敏试验结果显示，该菌对多种抗生素具有耐药性，这可能与养殖场抗生素滥用有关。
